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ELISA試劑盒時(shí)許多重要的環(huán)節(jié)都會(huì)影響到ELISA試劑盒檢測(cè)的質(zhì)量。

下面與大家分享幾種方法：

一、方法學(xué)的影響

ELISA測(cè)定模式包括以下幾種：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競(jìng)爭(zhēng)抑制法，其中競(jìng)爭(zhēng)抑制法因受操作時(shí)差所引起的競(jìng)爭(zhēng)等因素的影響，結(jié)果重復(fù)性較差，質(zhì)量較難控制。

二、試劑因素

（1）試劑的選擇

免疫檢測(cè)的原理均基于抗原抗體反應(yīng)。ELISA試劑盒由于該反應(yīng)過(guò)程受多種因素的影響，如普遍存在基質(zhì)效應(yīng)、交叉反應(yīng)等，因而檢測(cè)結(jié)果難以溯源，不同方法、不同試劑之間甚至同一試劑不同批號(hào)間結(jié)果均缺乏可比性。試劑質(zhì)量在很大程度上決定了檢測(cè)的水平，因此在引入新項(xiàng)目之前必須對(duì)試劑進(jìn)行嚴(yán)格的評(píng)估。試劑的評(píng)估有以下幾個(gè)步驟：⑴確定開(kāi)展該項(xiàng)目的必要性；⑵了解該項(xiàng)目現(xiàn)有的檢測(cè)方法和原理；⑶在了解試劑的組成基礎(chǔ)上選擇多家試劑盒進(jìn)行比較，判斷標(biāo)準(zhǔn)參考方法或參考物質(zhì)，其次為的滿意度及機(jī)構(gòu)的報(bào)告如各級(jí)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)、CDC報(bào)告等；⑷定期對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行追蹤反饋直至認(rèn)可該試劑。

（2）試劑的準(zhǔn)備

不同批次的ELISA試劑在制作過(guò)程中很難保證質(zhì)量一致，即使是通過(guò)批批檢的項(xiàng)目其檢測(cè)結(jié)果也存在差異，因此必須選擇和訂購(gòu)長(zhǎng)批號(hào)的試劑，并保證保存條件。嚴(yán)格執(zhí)行這一標(biāo)準(zhǔn)可以避免因試劑批號(hào)改變而重新建立質(zhì)控體系及重新評(píng)估試劑的復(fù)雜過(guò)程，并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性；對(duì)于效期短、使用率低的試劑，應(yīng)當(dāng)小量分裝，每次使用則取分裝部分即可，避免反復(fù)凍融造成試劑的失效。

試劑使用前必須平衡至室溫，否則會(huì)影響檢測(cè)下限。未用完的室內(nèi)質(zhì)控品及本次不需使用的試劑應(yīng)密封并及時(shí)放回冰箱保存。

三、樣本因素

標(biāo)本干擾因素包括內(nèi)源性干擾因素和外源性干擾因素，ELISA試劑盒前者包括類(lèi)風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、異嗜性抗體、自身抗體、等，后者包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、標(biāo)本凝固不全、冷凍標(biāo)本的反復(fù)凍融等。其中外源性干擾因素是我們?cè)跈z測(cè)過(guò)程中可以避免也是必須避免的因素，而避免內(nèi)源性因素的干擾則主要通過(guò)選擇合適的試劑盒。在中遇到少見(jiàn)的疑難病例時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮到內(nèi)源性干擾因素的存在。以下對(duì)外源性干擾因素進(jìn)行簡(jiǎn)要說(shuō)明：

（1）標(biāo)本溶血 要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其具有類(lèi)過(guò)氧化物的活性，因此，在以辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）為標(biāo)記酶的ELISA測(cè)定中，如果血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相，從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色。

（2）標(biāo)本被細(xì)菌污染 標(biāo)本的采集及血清分離要注意盡量避免細(xì)菌污染。細(xì)菌菌體中除可能含有內(nèi)源酶對(duì)測(cè)定產(chǎn)生非特異性干擾外，還可能對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用。另外標(biāo)本在保存中出現(xiàn)渾濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測(cè)。

（3）標(biāo)本貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 標(biāo)本在低溫下保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底加深、甚至出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。通常情況下血清標(biāo)本可在2～8℃下保存l周，冷凍保存時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)，但對(duì)于抗體或抗原含量低的標(biāo)本而言，則可能會(huì)因抗體掉價(jià)、抗原分解而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

（4）ELISA試劑盒標(biāo)本凝固不全 血液通常在采集后半小時(shí)后開(kāi)始凝固，18～24h凝固。如果在血液未凝固時(shí)即離心分離血清，則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽(yáng)性結(jié)果。為了縮短標(biāo)本處理時(shí)間，可以在離心前將血液標(biāo)本置于溫箱中溫育或者采用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽┮约铀傺宓姆蛛x。

（5）冷凍保存標(biāo)本避免反復(fù)凍融 標(biāo)本的反復(fù)凍融會(huì)因其所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，使抗體效價(jià)跌落從而引起假陰性結(jié)果，ELISA試劑盒所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝凍存。此外，標(biāo)本在凍存時(shí)會(huì)因蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，因此重新融解的標(biāo)本必須混勻，但不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒即可。 

上海通蔚生物技術(shù)員提醒顧客注意事項(xiàng)：“切勿使用過(guò)多的檢測(cè)試劑！如果濃度過(guò)高，或者未正確稀釋?zhuān)瑒t會(huì)導(dǎo)致高背景。ELISA試劑盒也不要顯色過(guò)度，如有必要，優(yōu)化一下何時(shí)應(yīng)加入終止液。